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良い選択肢のエージェントアプリケーションの修正

Sep 26, 2017

IHC / ICC実験で使用される全てのサンプルは、組織形態を維持し、目的の分子の抗原性を保持するために、固定化剤でなければならない。 固定剤は組織の化学組成を変化させるので、組織構造の維持とエピトープの保存との間の妥協を維持することがしばしば必要である。

細胞または組織の不完全な固定(不十分な固定)は、組織内の標的タンパク質の迅速な加水分解をもたらし、特異的な免疫反応性を低下させる。 しかし、過剰な固定(固定剤の過剰増殖)は、上皮マスキングまたは強い非特異的なバックグラウンド染色をもたらし、これは特定のマーカーを隠す可能性がある。

細胞および組織の形態を維持し、抗原の免疫活性の保存を最大にすることが最良である。 しかしながら、標準的な固定剤のいずれも、これまで様々な抗原固定のために使用されていなかった。 同じ固定液で固定した後、異なる組織は異なる染色結果を示すことがある。 したがって、最良の固定剤を選択するためには、異なる抗原およびサンプルを繰り返し試験しなければならない。

ホルムアルデヒドは、組織および細胞内タンパク質標的の最も一般的な固定剤である。 ホルムアルデヒド媒介性組織固定は、タンパク質 - タンパク質およびメチレン架橋(-CH 2 - )で架橋されたタンパク質 - 核酸の形成に依存すると考えられている。 ホルムアルデヒドは、NH 2(アミノ)およびCONH(ペプチド)基、NH 2およびNH、またはNH 2およびNH 2基を化学的に結合することができる。

ホルムアルデヒドは、ほとんどのIHC / ICC用途に適していますが、普遍的な固定剤ではありません。 ホルムアルデヒドの過剰な固定は、アミノ酸(エピトープの一部)を改変し、抗体の結合をブロックする。 しかし、ほとんどの場合、抗体修復技術を用いてエピトープを露出させて抗体結合を回復させることができる。 また、ホルムアルデヒドは、細胞膜から細胞質へのリン酸化依存性エピトープ転座を誘導することも示した。 この場合、氷で予め冷却した無水メタノールまたは無水エタノールが適切な代替物である。

最も一般的に使用される細胞および組織固定化アルコールは、メタノールおよびエタノールである。 メタノールとエタノールの分子構造は水の分子構造に似ています! したがって、それらはタンパク質水素結合のために水と競合して、組織中の水分子を置換する。 これは、タンパク質の誘電率を低下させることによって等電点でのタンパク質の定数を減少させ、立体構造の変化による抗体 - エピトープの結合をブロックする。 アルコールは水素結合を遮断することによってタンパク質の三次構造に影響を与えるが、タンパク質の二次構造を安定化させるようである。

しかしながら、アルコールはホルムアルデヒド固定剤のような組織形態を保持しないと一般に考えられている。 アルコールはホルムアルデヒドのように浸透せず、主に凍結組織切片および細胞を固定するために使用される。 したがって、アルコール固定は、膜表面抗原により適している。 アルコール修復は、一般にあまりにも重篤であると考えられ、組織切片または細胞の完全性を損なう可能性があるので、抗原修復はアルコール固定後には推奨されない。

組織サンプルとは異なり、培養細胞の固定時間はより短く、固定溶液の濃度はより低い。 例えば、2%ホルムアルデヒド溶液で室温で20分間、しばしば細胞形態および抗原性を保持するのに十分である。

細胞の培養は、通常は固定剤のみで​​培地を除去し、固定化剤溶液に加えることができる。 しかしながら、培地の除去後の表面張力の変化は、特定の細胞型を損なう可能性がある。 この場合、固定剤は媒体に直接添加されてもよい。 例えば、培地と同じ体積に4%ホルムアルデヒドを添加することにより、細胞を予備固定するのに十分な2%ホルムアルデヒド溶液が得られる。 2分後、プレ固定培地を新鮮な2%固定液と交換しなければならない。 プレ固定工程は、表面張力の変化によって引き起こされる可能性のある有害な影響に耐えることができるように、セルをより硬くする