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固定剤は細胞および組織の形態学的構造を維持する

Aug 03, 2017

IHC / ICC実験で使用される全てのサンプルは、組織形態を維持し、目的の分子の抗原性を保持するために、固定化剤でなければならない。 固定剤は組織の化学組成を変化させるので、組織構造の維持とエピトープの保存との間にトレードオフが存在することが多い。

細胞または組織の不完全な固定(不確定)は、組織内の標的タンパク質の迅速な加水分解をもたらし、特異的な免疫反応性を低下させる可能性がある。 しかし、過剰な固定(固定剤の過剰増殖)は、上皮マスキングまたは強い非特異的なバックグラウンド染色をもたらし、これは特定のマーカーを隠す可能性がある。

理想的な固定剤は、もちろん、細胞および組織の形態を維持し、抗原の免疫活性の保存を最大限にするのに最も良い方法です。 しかし、これまで様々な抗原固定のための標準的な固定化解決法は存在しない。 同じ固定液で固定した後、異なる組織は異なる染色結果を示すことがある。 したがって、最良の固定剤を選択するためには、異なる抗原およびサンプルを繰り返し試験しなければならない。

ホルムアルデヒドは、組織および細胞内タンパク質標的のための最も一般的な固定剤である。 ホルムアルデヒド媒介組織固定は、メチレン架橋(-CH 2 - )とのタンパク質 - タンパク質および核酸 - 核酸架橋の形成に依存すると考えられる。 ホルムアルデヒドは、NH 2(アミノ)およびCONH(ペプチド)基、NH 2およびNH、またはNH 2およびNH 2基を化学的に結合することができる。

ホルムアルデヒドは、ほとんどのIHC / ICC用途に適していますが、普遍的な固定剤ではありません。 ホルムアルデヒドの過剰な固定は、アミノ酸(エピトープの一部)を改変し、抗体の結合をブロックする。 しかし、ほとんどの場合、抗体修復技術を用いてエピトープを露出させて抗体結合を回復させることができる。 ホルムアルデヒドは、細胞膜から細胞質へのリン酸化依存性エピトープ転座を誘導することも示した。 この場合、氷で予め冷却した無水メタノールまたは無水エタノールが適切な代替物である。

★注意:ホルムアルデヒド溶液を分注し、凍結するか、4〜8℃で1ヶ月間保存してください。

最も一般的に使用される細胞および組織固定化アルコールは、メタノールおよびエタノールである。 メタノールとエタノールの分子構造は水の分子構造に似ています! したがって、それらは組織内の水分子を置換するタンパク質水素結合について水と競合する。 これは、タンパク質の誘電率を低下させることによって等電点でのタンパク質の定数を減少させ、立体構造の変化による抗体 - エピトープの結合をブロックする。 アルコールは水素結合を遮断することによってタンパク質の三次構造に影響を与えるが、タンパク質の二次構造を安定化させるようである。

しかしながら、アルコールはホルムアルデヒド固定剤のような組織形態を保持しないと一般に考えられている。 アルコールはホルムアルデヒドのように浸透せず、主に凍結組織切片および細胞を固定化するために使用される。 したがって、アルコール固定は、膜表面抗原に適している。 アルコール修復は、一般にあまりにも重篤であると考えられ、組織切片または細胞の完全性を損なう可能性があるので、抗原修復はアルコール固定後には推奨されない。

アセトンは、組織タンパク質の不可逆沈殿を引き起こすことができる強力な脱水剤である。 これは、固定剤ではなく、急速に凍った組織であるスライスによく使用されます。

固定剤の構成

マウス、ラットおよびモルモットのような小動物の完全性の研究では、動物全体の灌流固定が抗原を保存する最良の方法である。 それは動物の全血を置き換えるための固定液の使用を伴う。 しかし、全動物の潅流は、標的組織を固定するのに十分ではない。 これらの場合、解剖学的組織は固定剤に浸潤することができる。 例えば、4%ホルムアルデヒドは、組織灌流および浸潤固定のための一般的な解決策である。

浸潤固定中の固定化プロセスの浸透を強化するために、組織の厚さは10mm以下であることが推奨される。 完全な固定のためには、固定液の体積は、組織の体積の50〜100倍でなければならない。 固定は、通常、室温で4〜24時間行う。 不十分な固定または過剰な固定のために組織の免疫反応性を低下または崩壊させる可能性があるため、固定条件を最適化することが重要である。

細胞の培養

組織サンプルとは異なり、培養細胞の固定時間はより短く、固定溶液の濃度はより低い。 例えば、2%ホルムアルデヒド溶液で室温で20分間、しばしば細胞形態および抗原性を保持するのに十分である。

培養細胞の固定化は、通常、培地の除去および固定剤の添加のみである。 しかしながら、培地を除去した後の表面張力の変化は、特定の細胞型を損なう可能性がある。 この場合、固定剤は媒体に直接添加されてもよい。 例えば、培地と同じ体積に4%ホルムアルデヒドを添加することにより、細胞を予備固定するのに十分な2%ホルムアルデヒド溶液が得られる。 2分後、プレ固定培地を新鮮な2%固定液と交換しなければならない。 事前固定ステップは、細胞をより硬くして、表面張力の変化によって引き起こされる可能性のある有害な影響に耐えられるようにする